1). Ekstraksi sampel
a) Masing-masing sampel dari organ daun dan biji ditimbang 0,2 gram dengan timbangan elektrik.
b) Masing-masing sampel dari organ daun dan biji (@ 0,2 gram) dimasukkan dalam mortar.
c) Buffer ekstraksi 1000 ?l dimasukkan ke dalam mortar dan sampel dihaluskan dengan penggerus sampai larutan homogen, kemudian dituangkan ke dalam tabung eppendorf.
d) Hasil gerusan disentrifugasi pada kecepatan 13000 rpm (Rotary per Minute) selama 5 menit.
e) Supernatan diambil dan dipindahkan ke tabung eppendorf ukuran 1 ml.
2) Penyiapan sampel
a) Sampel hasil ekstraksi diambil 20 µl dan ditambahkan 5 µl loading dye.
b) Campuran sampel dan loading dye dipanaskan pada air mendidih selama 2 menit lalu disimpan semalam dalam freezer.
c) Sampel telah siap untuk running pada gel elektroforesis.
3) Pembuatan gel SDS
a) Glass plate disiapkan, klem, specer, dan dipasang gel stand.
b) Dicampurkan 10 ml larutan stock SDS 10%, 7 µl TEMED, (N,N,N’,N’, tetramethylethylene diamine), dan 80 µl APS (Ammonium Persulphate) pada gelas beker dan aduk sampai rata.
c) Larutan tersebut dituang pada glass plate sampai 1 cm di bawah batas glass plate, diberi isobutanol untuk meratakan permukaan gel.
d) Jika gradien gel telah kering, isobutanol dibersihkan dengan menuang aquades dan diserap dengan tisu kering
e) Tambahkan stecking gel SDS 3% yang terdiri dari 3,5 ml SDS 3%, 10 µl TEMED dan 20 µl APS.
f) Letakkan sisir (comb) pada permukaan Stecking gel.
g) Ditunggu sampai mengeras untuk dapat digunakan dalam elektroforesis.
4) Running protein
a) Gel yang telah siap, dibuka sisir dan klemnya kemudian diletakkan pada alat elektroforesis.
b) Tiap sampel dimasukkan pada sumuran sesuai dengan tempatnya.
c) Dituangkan running buffer hingga menutupi seluruh permukaan gel.
d) Dipasang tutup sesuai dengan tanda polaritasnya.
e) Power supply dijalankan pada tegangan 85 V sehingga loading dye mencapai batas bawah.
f) Setelah loading dye mencapai batas bawah power supply dimatikan dan gel dikeluarkan untuk proses staining.
5). Pewarnaan - Gel dimasukkan ke dalam cawan yang berisi larutan pewarna Commasie blue, dan dibiarkan selama 24 jam.
6). Destaining - Gel dikeluarkan dari larutan pewarna kemudian dibilas dalam aquades, baru kemudian dimasukkan ke dalam larutan destaining selama 4 jam sambil digoyang dengan menggunakan shaker
7). Dokumentasi - Gel yang telah di destaining didokumentasi menggunakan kamera digital dengan sinar tampak dari belakang sampel untuk memperjelas transparasi sampel
9). Penyimpanan - Gel yang telah didokumentasi dipres menggunakan plastik mika dan disimpan dalam almari es.
Tidak ada komentar:
Posting Komentar