A. Pendahuluan
1. Latar Belakang
Kultur jaringan tanaman merupakan salah satu aplikasi dari bioteknologi tanaman yang merupakan budidaya tanaman yang dikerjakan secara in-vitro (dalam wadah tertutup atau dalam botol). Kultur jaringan dalam bahasa asing disebut sebagai tissue culture, weefsel cultures atau gewebe kultur.
Kultur jaringan didefinisikan sebagai suatu teknik menumbuhkembangkan bagian tanaman baik berupa sel, jaringan atau organ dalam kondisi aseptik secara in-vitro, yang dicirikan kondisi kultur yang aseptic, penggunaan media kultur buatan dengan kandungan nutrisi lengkap dan ZPT (Zat Pengatur Tumbuh) serta kondisi ruang kultur yang suhu dan pencahayaannya terkontrol.
Sterilisasi dan pembuatan media kultur menjadi alternative pilihan pertama untuk melaksanakan kultur jaringan. Pada saat ini teknik kultur jaringan telah banyak dimanfaatkan dalam usaha pelestarian plasma nutfah tanaman. Keutungan yang dapat diambil dari penggunaan kultur jaringan untuk pelestarian tanaman antara lain efisiensi untuk tanman yang tidak berbiji atau tanaman berbiji rekalsitran, tidak memerlukan ruang atau lahan yang luas, resiko kegagalan karena iklim atau penyakit dapat dihindari, memungkinkan dilakukannya manipulasi genetic dan bibit yang dihasilkan lebih sehat
Prospek kultur jaringan pada masa sekarang cukup menjanjikan menyangkut peningkatan hasil produksi serta peningkatan mutu dan kualitas produksi bibit yang dihasilkan.
2. Tujuan
- Mengetahui prosedur sterilisasi alat-alat penanaman.
- Mengetahui langkah-langkah dalm pembuatan media kultur jaringan.
3. Waktu dan Tempat Praktikum
Praktikum sterilisasi alat dan pembuatan media kultur ini dilaksanakan pada hari Rabu tanggal 28 November 2007, di Laboratorium Fisiologi Tanaman dan Bioteknologi Fakultas Pertanian Universitas Sebelas Maret Surakarta.
B. Tinjauan Pustaka
Teknik Kultur Jaringan adalah mengisolasi bagian tanaman ( sel, jaringan, organ ) seperti daun mata tunas serta menumbuhkan bagian-bagian tersebut dalam media buatan secara aseptic yang kaya nutrisi lengkap dan zat pengatur tumbuh dalam wadah tertutup yang tembus cahaya sehingga bagian tanaman dapat memperbanyak diri dan bergenerasi menjadi tanaman lengkap ( Husni, A.1997 )
Teknik ini dicirikan oleh kondisi aseptic, penggunaan media kultur buatan dengan kandungan nutrisi lengkap dan ZPT ( zat pengatur tumbuh ), serta kondisi ruang kultur yang suhu dan pencahayaannya terkendali. Kultur jaringan merupakan salah satu aplikasi dari bioteknologi tanaman yang dikerjakan secara in vitro ( Martin, 1994 )
Zat pengatur tumbuh pada tanaman adalah senyawa organic yang bukan hara, yang dalam jumlah sedikit dapat mendukung, menghambat dan merubah proses fisiologis tumbuhan.Zat pengatur tumbuh hanya diperlukan dalam jumlah sedikit sekali ( Abidin, 1999 )
Dalam kultur jaringan terdapat beberapa aspek yang berpengaruh terhadap keberhasilan perbanyakan tanaman antara lain keseimbangan zat pengaturan zat pengatur tumbuh yang terkandung dalam media menentukan arah suatu kultur. Auksin dan sitokinin merupakan zat pengatur tumbuh yng sering digunakan dalam kultur jaringan. Sitokinin dan auksin dalam keseimbangan yang tepat berpengaruh terhadap proses organogenesis (Winarsih, dan Priyono, 2000).
Komponen media kultur yang lengkap sebagai berikut:
- Air destilasi (aquadest) atau air bebas ion sebagai pelarut atau solven.
- Hara-hara makro dan mikro.
- Gula (umumnya sukrosa) sebagai sumber eneergi.
- Vitamin, asam amino dan bahan organic lain.
- Zat pengatur tumbuh.
- Suplemen berupa bahan-bahn alami, jika diperlukan.
- Agar-agar atau gelrite sebagai pemadat media (Yusnita,2004 ).
Pembuatan media tumbuh yang terdiri atas campuran garam mineral berisi unsure makro dan unsure mikro, asam amino, vitamin, gula serta hormone tumbuhan dengan perbandingan tertentu. Untuk membuat media cair bahan-bahan dicampur air suling, sedang untuk membuat media padat, bahan-bahan dicampur dengan agar-agar. Media yang sudah dibuat lalu disterilkandalam autoklaf kemudian media ditempatkan dalam botol erlenmeyer (Butcher dan street, 1964).
Autoklaf merupakan sebuah bejana yang dapat diisi air dan ditutup rapat-rapat. Kalau air dipanaskan, uap yang terjadi tidak dapat keluar, sehingga tekanan dalam autoklaf naik sampai lebih tinggi daripada tekanan normal. Pertambahan tekanan menyebabkan air mendidih diatas titik didih normal. Kalau dalam keadaan biasa air mendidih pada suhu 100°C (Narayaswami dan Norstog, 1964).
Sterilitas dengan autoklaf adalah suatu metode sterilitasasi dengan uap air dibawah tekanan. Kapas penyumbat, kasa, peralatan laboratorium, plastic penutup, peralatan gelas, penyaring, pipet, air, dan media nutrisi dapat disterilisasi dengan autoklaf. Hampir semua mikroba mati apabila terkena uap air yang sangat panas dari autolaf selama 10-15 menit. Semua obyek hendaknya disterilisasi pada suhu 121o C dan takanan 15 Psi selama 15-20 menit (Teres, 1989).
C. Alat, Bahan dan Cara Kerja
1. Alat
a. Peralatan untuk penanaman eksplan
• Laminar Air Flow Cabinet (LAFC)
• Petridish dan botol-botol kultur
• Peralatan direksi, seperti :pinset, pisau pemes, gunting
Alat-alat penanaman, yaitu petridish dan peralatan diseksi dibungkus dengan kertas, kemudian disterilisasi di dalam autoklaf pada tekanan 1,5 kg/cm2 selama 45 menit. Setelah disterilisasi, alat-alat tersebut disimpan di dalam oven
b. Peralatan untuk pembuatan media
• Timbangan analitik
• Botol-botol kultur
• pH meter
• gelas piala
• pipet
• plastic pp 0,3 mm
• karet gelang
• kertas label
2. Bahan
• Aquadest
• Larutan stok
• Agar-agar
• Gula
• NaOH 1 N dan HCl 1 N
3. Cara Kerja
a. Pembuatan Larutan Stok
1) Larutan Stok Media
• Menimbang bahan – bahan kimia yang telah dikalikan menjadi beberapa kali konsentrasi
• Melarutkan bahan-bahan kimiatersebut kedalam aquades dengan volume tertentu
• Memasukkan masing-masing larutan kedalam btol dan menyimpannya ke dalam refigenerator
2) Larutan Stok Zat Pengatur Tumbuh
• Menghiutung kebutuhan bahan BAP 100 pmm sebanyak 300 ml adalah sebagai berikut: 100 ppm = 100 mg/l, >30 mg/300 l
• Menghiutung kebutuhan bahan paclobutrazol 100 pmm sebanyak 100 ml adalah sebagai berikut: 100 ppm = 100mg/l, >10mg/100 l
• Melarutkan bahan dengan alcohol atau NaOH 1 N kemudian ditambah dengan aquadest sampai 300ml untuk BAP dan 100 ml untuk paclobutrazol
• Memasukkkan masing-masing larutan tersebut kedalam botol dan menyimpannyaa ke dalam refigenerator
b. Pembuatan Media
- Mengambil masing-masing larutan stok sesuai dengan ukuran yang telah ditentukan yaitu:
o NaEDTA FeSO4 = 50 ml / L didapat dari : 10 L / 500 ml = 500 : 10 = 50 ml
o Makro = 50 ml / L didapat dari : 10 L / 500 ml = 500 : 10 = 50 ml
o Mikro = 5 ml / L didapat dari :100 L / 500 ml = 500 : 100 = 5 ml
o Vitamin = 25 ml / L didapat dari : 10 L / 250 ml = 250 : 10 = 20 ml
- Mengambil larutan stok ZPT sesuai dengan perlakuan yaitu ZPT :
o Paklobutrazol = 5 ml / L
o BAP = 20 ml / L
Konsentrasi keduanya 100 ppm
Adapun perhitungannya adalah :
- BAP
V1 x M1 = V2 X M2
V1 x 100 = 1000 x 2
V1 = 20 ml / L
- Paklobutrazol
V1 x M1 = V2 x M2
V1 x 100 = 1000 x 0,5
V1 = 5 ml / L
Keterangan :
V1 = volume larutan stok yang diambil
M1 = dosis larutan stok yang tersedia
V2 = volume media yang akan dibuat
M2 = dosis media yang akan dibuat
- Memasukkan larutan stok kedalam labu takar kemudian menambahkan aquadest sampai 1000 ml / sampai tanda ( pengenceran larutan stok )
- Memasukkan larutan kedalam beker glas.
- Menambah gula sebanyak 30 gr
- Mengatur pH dengan kisaran 5,8-6,3 dengan menambahkan beberapa tetes NaOH untuk menaikkan pH atau HCl untuk menurunkan pH
- Menambah agar-agar 8 gr kemudian dididihkan
- Menuangkan larutan media ke dalam botol-botol kultur kurang lebih 25 ml tiap botol
- Menutup botol berisi larutan media dengan plastic
- Memasukkan botol-botol berisi media kedalam autoklaf untuk proses sterilisasi pada tekanan 1,5 kg/cm3 selama 45 menit
- Menyimpan media pada rak penyimpan media yang bertujuan untuk mengantisipasi ada tidaknya kontaminasi pada media sehingga dapat dicegah penggunaan media yang telah terkontaminasi pada saat penanaman.
c. Media Penanaman
Dalam praktikum ini, media yang digunakan adalah media Murashige dan Skoog (MS) yang dimodifikasi dengan penambahan ZPT BAP 2 ppm dan Paclobutrazol 0,5 ppm. Media kultur tersebut digunakan untuk penanaman 4 macam eksplan dengan masing-masing eksplan diulang sebanyak 2 kali untuk setiap mahasiswa (praktikan).
DAFTAR PUSTAKA
Abidin, Z. 1999. Zat Pengatur Tumbuh. WWW. Google. co. id. 9 Januari 2008.
Butcher, D.M and H.E. Street. 1964. Excised Root Culture. The Botanical Review, No. 4 : 513-586.
Husni, A. 1997. Perbanyakan dan Penyimpangan Tanaman Melalui Kultur Jaringan. Buletin Plasma Nutfah. Vol. II (1 ) : 9-13
Martin, B. M. 1994. Tissue Culture Techniques : an introduction. Birkhauser. Boston.
Narayaswami dan Norstog. 1964. Horticultural Tecniques. Storstoch. California.
Terres, K. C. 1989. Tissue Culture Techniques For Horticultural crops. Van Nostrand Relohoid. New York.
Winarsih, S. dan Priyono. 2000. Pengaruh Zat Pengatur Tumbuh Terhadap Pembentukan dan Pengakaran Tunas Mikro Pada Asperagus Secara In Vitro. Jurnal Hortikultura. Vol 10 (1): 11-17.
Yusnita. 2004. Kultur Jaringan Cara Memperbanyak Tanaman secara Efisien. Agromedia Pustaka. Jakarta.
Tidak ada komentar:
Posting Komentar